Nature Communications:细胞色素P450酶工程改造突破常规蛋白质诱变限制

细胞色素 P450 酶是自然界中用途最广泛的生物催化剂之一，它在许多天然药物或活性天然产物的生物合成过程中发挥关键作用。

自 1962 年被 JBC 杂志报道以来，细胞色素 P450 酶已被广泛研究，包括结构特征、催化机制、调节和生物化学的许多其他方面，它的工程化发展、新型酶特性的挖掘，为其进一步应用提供了方向。

为了设计具有所需反应性和选择性的 P450 突变体，已经开发了多种有效的诱变策略，例如 CAST、CAST/ISM 和 FRISM，并取得了巨大成功。

然而，利用 20 种蛋白质源性氨基酸产生突变体并不总是能够满足 P450 酶定点或随机突变以及蛋白质理性设计的所有需求。因此，需要新的方法来突破这种常规蛋白质诱变限制。

近日，在 Nature Communications 上在线发表了题为 “Unnatural activities and mechanistic insights of cytochrome P450 PikC gained from site-specific mutagenesis by non-canonical amino acids” 的研究论文，研究人员通过对一种微生物天然产物生物合成 P450 酶进行非天然氨基酸介导的半理性突变，获得了具有非天然活性的突变体，并在体外通过构建人工酶级联反应，获得了多种非天然大环内酯类化合物。

（来源：Nature Communications）

山东大学微生物技术国家重点实验室博士研究生潘云军和博士后李国邦为并列第一作者，李盛英教授和高翔教授为共同通讯作者。

研究人员以大环内酯类抗生素——苦霉素的生物合成途径为研究对象。针对途径中关键 P450 酶 PikC 的关键氨基酸位点进行了半理性非天然氨基酸突变。

▲图丨代表性的大环内酯类生物合成途径（来源：Nature Communications）

大环内酯类抗生素（macrolides antibiotics，MA）是一类分子结构中具有 12-16 碳内酯环的抗菌药物的总称，属于快速抑菌剂，主要用于治疗需氧革兰阳性球菌和阴性球菌、某些厌氧菌以及军团菌、支原体、衣原体等感染。研究表明大环内酯类抗生素除了抗菌作用外, 还具有其他广泛的药理作用。

通常情况下，PikC 通过独特的糖锚定机制识别具有脱氧糖胺的 12 或 14 元环大环内酯底物。

为了将 PikC 的底物特异性从加糖的大环内酯类改变为相应的糖苷配基，研究人员基于半理性设计的底物结合策略，利用非天然氨基酸正交翻译技术将一系列非天然氨基酸引入该酶的 His238 位点，获得了唯一一个能够催化 10-DML 和 narbonolide 发生羟基化反应的突变体 PikCH238pAcF。

▲图丨PikCH238pAcF 的设计与制备（来源：Nature Communications）

也就是说， PikC 非天然氨基酸突变体（PikCH238pAcF）对没有任何糖锚定基团的大环内酯底物产生了前所未有的活性。同时，这也提高了对天然底物的催化性能。

▲图丨PikC 突变体功能分析（来源：Nature Communications）

此外，研究人员利用 PikCH238pAcF 和具有底物宽泛性的糖基转移酶在体外构建人工酶级联反应，获得了多种非天然大环内酯类化合物。

文章讨论部分指出，这种基于非天然氨基酸定点突变的 P450 酶工程策略，以及从酶-底物复合物的详细结构分析中获得的机制，可以应用于未来更多的糖基化-氧化耦合系统。

▲图丨对三种不同底物结合下的 PikCH238pAcF 晶体结构的分析（来源：Nature Communications）

这种生物合成途径重编程也可以在体内进行，预计将创建更多微调酶促反应或级联反应，并且可以生产设计更合理的天然产物衍生物。