基因工程的新工具 生命最古老的分支

伊利诺伊大学比尔梅特卡夫微生物学教授g .威廉阿伦兹和博士后研究员迪皮蒂纳亚克的一项新研究首次记录了CRISPR-Cas9介导的基因组编辑在生命的第三个领域——古细菌中的应用。他们发表在《美国国家科学院院刊》上的开创性工作可能会大大加速这些生物的未来研究，并对包括全球气候变化在内的研究产生影响。梅特卡夫和纳亚克是伊利诺伊州卡尔沃尔斯基因组生物学研究所的成员。

“在大多数情况下，与大肠杆菌相比，我们的模式古细菌醋酸甲烷八叠球菌的倍增时间为8至10小时，大肠杆菌可以在大约30分钟内倍增。这意味着遗传和获得突变体可能需要几个月的时间——同样的事情在大肠杆菌中需要三天，”纳亚克解释说。“在非常基本的层面上，CRISPR-Cas9让我们能够做到的是加快整个流程。它消除了一个主要瓶颈.用这个古细菌做基因研究的时候。

“更有甚者，”纳亚克继续说道，“通过我们以前的技术，突变必须一步一步引入。利用这项新技术，我们可以同时引入多个突变。我们可以利用CRISPR扩大突变体生成的过程。”

CRISPR是簇状规则间隔短回文重复的缩写，它开始作为古细菌和细菌的免疫防御系统。Cas(CRISPR相关系统)蛋白通过识别和储存外源DNA的短片段，可以在未来快速识别DNA，从而快速破坏，保护机体免受病毒入侵。

自从被发现以来，免疫系统的一个版本——CRISPR-Cas9——已经被修改以在实验室编辑基因组。通过将Cas9与特定的工程RNA导向的而不是侵入性的DNA片段配对，可以引导CRISPR系统在任何位置切割细胞基因组，从而去除现有基因或添加新基因。该系统在编辑来自酵母、植物、鱼类甚至人类细胞的真核系统方面有着丰富的经验，获得了美国科学促进会2015年度突破奖。然而，其在原核物种中的实施遇到了障碍，部分原因是其不同的细胞过程。

为了在细胞系统中使用CRISPR，研究人员必须开发一种方案，该方案考虑到细胞首选的DNA修复机制：在CRISPR的“分子剪刀”切割染色体后，细胞修复系统通过一种机制介入修复损伤。其他遗传物质可以通过。在真核细胞中，这采取非同源末端连接的形式(NHEJ)。虽然这种方法已经被用于CRISPR介导的编辑，但它有一种倾向，即在其修复过程中引入遗传错误：核苷酸，DNA阶梯的步骤，通常在切割位点添加或删除。

NHEJ在原核生物中非常罕见，包括古细菌；相反，它们的DNA通常通过一种叫做同源定向修复的过程进行修复。通过比较DNA模板的损伤，同源定向修复创造了Nayak所说的“确定性模板”——最终结果可以提前预测，并根据研究人员的确切需求进行调整。

在许多方面，同源定向修复实际上更适合基因组编辑：“虽然我们希望CRISPR-Cas9在真核系统中被定向编辑，但因为NHEJ，我们经常得到我们不想要的东西，”Nayak解释说。“在这方面，大部分古细菌菌株不具备非同源末端连接的修复系统是一件好事，所以DNA能够修复的唯一途径就是通过这种确定性的同源修复途径。”

虽然看似违反直觉，纳亚克和梅特卡夫首先使用CRISPR-Cas9将NHEJ机制引入甲烷八叠球菌。纳亚克说，尽管基因组编辑通常不受欢迎，但NHEJ有一个优于同源修复的用途：“如果你只想删除一个基因，如果你不在乎如何删除.非同源末端连接实际上更有效。”

通过使用引入的NHEJ修复系统的所谓“敲除”研究，其中单个基因被移除或沉默，以观察基因可能影响的变化和过程，纳亚克说，未来的研究将能够组装醋杆菌和其他古老物种的遗传图谱。这样的图谱对于涉及古细菌的各种研究领域非常有用，包括梅特卡夫实验室特别感兴趣的领域，即气候变化。

“甲烷八叠球菌是最具遗传性的古老菌株之一，”纳亚克说。“[产甲烷细菌]是一种古生物，每年都会产生这种强大的温室气体。它在全球碳循环中发挥着重要作用，因此对全球气候变化做出了重大贡献。”通过研究这种生物和类似生物的遗传学，纳亚克和梅特卡夫不仅希望对古菌遗传学有更深入的了解，还希望获得它们在更广泛的环境过程中的作用。

总之，这项研究代表了一个令人兴奋的研究和操纵古细菌的新方向。“我们开始这项研究是为了确定CRISPR-Cas9基因组编辑是否可以用于古菌，”Nayak总结道。“我们发现，与真核系统相比，这不仅是可能的，而且非常有效。”